Judul : Principles of Nucleic Acid Separation by Agarose Gel Electrophoresis
Pengarang : Muhittin Yilmaz, Cem Ozic, dan Ilhami Gok
Resume Jurnal :
a. Latar Belakang
Elektroforesis
dengan menggunakan gel agarose adalah sebuah metode yang biasa digunakan untuk
memisahkan protein, DNA, atau RNA. Motode ini menggunakan medan listrik untuk
memisahkan molekul asam nukleat berdasarkan ukurannya. Dalam penerapannya,
penambahan konsentrasi gel agarose akan mengurangi kecepatan perpindahan dan
akan memudahkan dalam proses pemisahan molekul DNA. Untuk visualisasi asam
nukleat dalam metode ini biasanya menggunakan Ethidium Bromida. Ethidium
Bromida merupakan pewarna berpendar yang digunakan untuk mempermudah
pendeteksian asam nukleat. Faktor-faktor yang mempengaruhi perpindahan fragmen
DNA, yaitu konsentrasi larutan agarose, voltase, buffer elektroforesis, dan Ethidium
Bromida.
b. Manfaat
Elektroforesis
dengan sel agarose secara luas digunakan untuk memperkirakan ukuran dari
fragmen DNA setelah direaksikan dengan enzim retriksi, misalnya dalam pemetaan
pembatasan DNA kloning. Metode elektroforesis biasa digunakan dalam diagnosa genetic
molekuler atau pendeteksian sidik jari dengan analisis produk PCR. Elektroforesis
dengan sel agarose juga digunakan untuk memisahkan DNA sirkular dengan topologi
yang berbeda.
c. Metode
Dalam elektroforesis dengan sel agarose, molekul asam nukleat terpisah
berdasarkan ukuran dalam medan listrik dimana molekul negatif bergerak menuju
kutub positif. Motode ini menggunakan bermacam-macam material, yaitu asam nukleat
dan oligonukleotida yang berupa sampel DNA, DNA standar, dan produk PCR.
Dibutuhkan juga beberapa buffer dan larutan, seperti larutan agarose, buffer
elektroforesis, dan sebagainya. Buffer Elektroforesis ada 3 macam, yaitu TAE,
TPE, dan TBE. Larutan pewarna DNA juga dibutuhkan untuk pendeteksian asam
nukleat, seperti Ethidium Bromida atau SYBR Green.
d. Cara Kerja
1.
Siapkan larutan agarose di dalam buffer
elektroforesis dengan konsentrasi yang sesuai untuk memisahkan fragmen ukuran
tertentu yang diinginkan dari sampel DNA.
2.
Jika menggunakan botol kaca, lepas tutupnya.
Panaskan campuran di dalam air panas atau microwave sampai agarose larut.
3.
Gunakan sarung tangan yang terisolasi untuk
memindahkan labu pada wadah air panas yang bersuhu 55°C. Ketika gel telah dingin,
tambahkan ethidium bromida untuk konsentrasi akhir 0.5 μg/ml. Campurkan larutan gel
secara menyeluruh dengan memutarnya lembut.
4.
Sementara larutan agarose didinginkan, pilih comb yang sesuai untuk membentuk slot
sampel di dalam gel. Posisikan comb
0.5-1.0 mm dibawah plat sehingga sebuah “sumur” terbentuk ketika agarose
ditambahkan ke cetakan.
5.
Tuangkan larutan agarose hangat ke dalam cetakan.
6.
Biarkan selama 20-45 menit dalam suhu kamar,
lalu tuangkan sedikit buffer elektroforesis, dan cabut comb dengan hati-hati.
Tuangkan buffer elektroforesis dan hati-hati dalam melepaskan pitanya. Pasang
gel dalam tangki elektroforesis.
7.
Tempatkan
gel pada perangkat elektroforesis dan cukupi buffer untuk menutupi gel
hingga kedalaman kira-kira 1mm.
8.
Campurkan sampel dengan pewarna dengan
perbandingan 1:5 atau 1:10.
9.
Isikan sampel campuran dengan perlahan ke dalam
slot dengan mikropipet, mikropipet otomatis, atau Pasteur pipet.
10.
Tutup tangki dan berikan aliran listrik sehingga
DNA bergerak menuju kutub positif. Gunakan voltase 1-5 V/cm. Jika listrik
terpasang sempurna, maka gelembung tidak akan muncul pada anoda maupun katoda.
Bromophenol blue dan xylene cyanol FF akan bergerak ke badan gel.
11.
Ketika DNA sampel atau pewarna telah bergerak
untuk jarak yang cukup ke gel, matikan listrik dan lepaskan tutup dari tangki
gel. Jika tidak, rendam dalam buffer elektroforesis atau air yang mengandung
ethidium bromide 0.5 μg/ml selama 20-45 menit dengan suhu ruang atau dengan
merendam dalam 1: 10.000 SYBR Green di dalam buffer elektroforesis.
»» terus gimana yaaaa...